Klondan klonla sekanslama sırasında, DNA sekanslanmaya hazır fragmanlara bölünmeden önce genomun her kromozomunun bir haritası yapılır.
- Genomu klonla klonlamada 150 kilobazlık büyük parçalara ayrılır uzunluğunda (150.000 baz çifti ).
- Bu parçaların kromozomlardaki yeri sekanslamadan sonra sırayla monte edilmelerine yardımcı olmak için kaydedilir (eşlenir).
- Parçalar daha sonra Bakteriyel Yapay Kromozomlara yerleştirilir (BAC) ve büyümek için bakteriyel hücrelerin içine koyun.
- DNA parçaları bakterilerin her seferinde kopyalanıyor çok sayıda özdeş kopya üretmek için bölün.
- Bireysel bakteri klonlarındaki DNA daha sonra üst üste binen küçük parçalara bölünür. Her parça 500 baz çifti uzunluğundadır, böylece sekanslama için daha yönetilebilir bir boyuttadırlar.
- Bu fragmanlar bir vektöre konur bilinen bir DNA sekansına sahiptir.
- Daha sonra DNA fragmanları, vektörün bilinen sekansı ile başlayıp bilinmeyen DNA sekansına uzanan sekanslanır.
- Sekanslama sonrasında, küçük DNA fragmanları, başlangıçta BAC’lere yerleştirilen büyük parçaları yeniden biçimlendirmek için örtüşme alanlarını belirleyerek bir araya getirilir.
- Bu ‘montaj’, üst üste binen alanları tespit eden ve DNA dizisini bir araya getiren bilgisayarlar tarafından gerçekleştirilir.
- Daha sonra, başlangıçta inşa edilen haritayı takip ederek, büyük parçalar, tam genom dizisinin bir parçası olarak kromozomlara geri monte edilebilir.
- Klondan klon yaklaşımı 1980’lerde ve 1990’larda nematod solucanı, C. elegans ve maya S. cerevisiae’nin genomlarını sıralamak için kullanıldı .
- İnsan Genom Projesi sırasında klon-klon dizilimi tercih edilen yöntem 2001 yılında tamamlanmıştır.
Klondan klonla dizilemenin avantajları nelerdir?
- Her DNA fragmanı, genomun bilinen bir bölgesinden alınır, bu nedenle sekansta herhangi bir boşluğun nerede olduğunu belirlemek nispeten kolaydır.
- Bir genom haritası nedeniyle montaj daha güvenilir bilim adamları daha büyük parçaların birbirleriyle nerede ilişkili olduğunu bilirler.
- Her bir parça farklı olduğu için birçok insan aynı anda genom üzerinde çalışabilir.
Klondan klon diziliminin dezavantajları nelerdir?
- Klonlar yapmak ve genom haritaları oluşturmak uzun zaman alır.
- Klonla klon dizilimi genellikle diğer dizileme yöntemlerinden daha pahalıdır.
- Kromozomların sentromerler gibi bazı kısımlarını klonlamak zordur. Bunun nedeni, BAC’leri kesmelerini ve klonlamalarını zorlaştıran uzun tekrarlayan bölümler içermesidir. Sonuç olarak, klonla klonla sekanslama yöntemlerini kullanarak sekanslama yapamazsınız.
